A micróglia humana mostra alterações transcricionais únicas na doença de Alzheimer

Nature Aging (2023) Cite este artigo

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Microglia, as células imunes inatas do cérebro, influenciam a progressão da doença de Alzheimer (AD) e são potenciais alvos terapêuticos. No entanto, a micróglia apresenta diversas funções, cuja regulação não é totalmente compreendida, dificultando o desenvolvimento de terapêuticas. Para melhor definir os fenótipos transcriptômicos e as redes reguladoras gênicas associadas à DA, enriquecemos os núcleos da microglia de 12 AD e 10 córtices pré-frontais dorsolaterais humanos de controle (7 homens e 15 mulheres, todos com idade > 60 anos) antes do sequenciamento de RNA de núcleo único. Aqui descrevemos os fenótipos moleculares microgliais estabelecidos e não reconhecidos anteriormente, as redes de genes inferidas que conduzem à mudança transcriptômica observada e aplicamos a análise de trajetória para revelar as relações putativas entre os fenótipos microgliais. Identificamos fenótipos microgliais mais prevalentes em casos de DA em comparação com controles. Além disso, descrevemos a heterogeneidade em subclusters microglia expressando marcadores homeostáticos. Nosso estudo demonstra que o perfil profundo da microglia no cérebro humano com DA pode fornecer informações sobre as alterações transcricionais microgliais associadas à DA.

A doença de Alzheimer (AD) é patologicamente caracterizada por placas extracelulares de beta-amilóide (Aβ), emaranhados neurofibrilares intracelulares neuronais e neuroinflamação. O interesse na neuroinflamação como uma característica modificável da patologia da DA cresceu em conjunto com estudos genéticos que identificam variantes de risco de DA localizadas em regiões codificantes e não codificantes de genes exclusivamente expressos por células mielóides cerebrais1. As micróglias são células mielóides imunes inatas residentes do cérebro e contribuem para os processos neuroinflamatórios hipotetizados para promover a fisiopatologia da DA2,3,4,5,6,7,8,9,10. Estudos anteriores sugeriram que, na DA, a microglia libera mediadores inflamatórios que influenciam o comportamento e a função dos neurônios circundantes, e a glia perde funções neuroprotetoras e inicia fagocitose aberrante de sinapses e neurônios3,7,11,12. A microglia parece contribuir para a disseminação da tau em sistemas modelo13,14 e é provável que seja o tipo de célula primária envolvida na remoção de Aβ, incluindo a redução de Aβ observada em resposta a abordagens de imunoterapia baseadas em anticorpos15. Como tal, os comportamentos inflamatórios da microglia são relevantes para o desenho do alvo terapêutico. No entanto, grandes lacunas permanecem em nossa compreensão das respostas da microglia no cérebro com DA.

Os fenótipos da micróglia são diferenciados pela morfologia, fisiologia e padrões de expressão de genes ou proteínas. Experimentos realizados em sistemas modelo sugerem que essas características heterogêneas provavelmente se associam a fenótipos funcionais específicos da microglia10,16,17,18,19,20,21. Pouco se sabe sobre a heterogeneidade dos fenótipos da micróglia no cérebro humano adulto, especialmente no contexto de doenças específicas, como a DA. Estudos de sequenciamento de RNA de célula única e de núcleo único (snRNA-seq) de tecido cortical humano fresco e congelado revelaram múltiplos fenótipos transcricionais de micróglia no contexto de DA e outras patologias cerebrais22,23,24,25,26,27,28, 29. Distinguir clusters transcriptômicamente distintos permite a identificação de fatores genéticos e epigenéticos candidatos que regulam comportamentos celulares específicos, que podem ser aproveitados em abordagens terapêuticas de precisão. No entanto, os métodos padrão de snRNA-seq geralmente incluem um pequeno número de micróglias por indivíduo. Baixos números de células podem diminuir a capacidade de mapear toda a gama de fenótipos transcricionais microgliais e limitar a capacidade de identificar alterações na expressão gênica associadas a doenças em um cluster ou subcluster. Nossa hipótese é que processos celulares adicionais e fatores reguladores dos fenótipos transcricionais da micróglia seriam descobertos usando conjuntos de dados que contêm números muito maiores de micróglia por amostra individual.

1.25. Cluster 1 was annotated as inactivated, often referred to as ‘homeostatic’ in single-nucleus studies of microglia. Differential gene expression analysis was repeated as above comparing each other cluster to cluster 1. GSEA was performed in ClusterProfiler69 modified to use a set seed for reproducibility, using the GO, KEGG and Reactome pathway sets, version 7.2. Enriched pathways had an FDR-adjusted P < 0.05. We considered pathways to be representative if significant results included similar genes and biological functions in at least two of the three major databases (GO, KEGG and Reactome)./p>60 years. Because the samples were obtained from humans, and the study was designed to detect differences between AD cases and healthy aged brains, the samples were not randomized between conditions. We counterbalanced sequencing batches by sex and disease status such that all conditions were present in each sequencing batch. Statistical analysis for pseudobulk RNA-seq data and snRNA-seq data used DESeq2 and MAST, respectively. DESeq2 is designed to model the RNA-seq count data by a negative binomial distribution, and MAST is designed to model the zero inflation observed in snRNA-seq data. For statistical analysis of cluster proportion, counts data were used, which does not rely on a normal distribution. When the dataset was downsampled for trajectory analysis and regulon detection, the nuclei were randomly downsampled to generate multiple iterations of the dataset that evenly represented the clusters and kept the samples in their original proportions. For trajectory analysis, three downsampled permutations at three downsample resolutions (1,000, 2,000 or 3,000 nuclei per cluster) were analyzed for a total of nine iterations, resulting in similar findings as those displayed in Fig. 4. For pySCENIC regulon detection, the dataset was downsampled with five permutations at 1,000 nuclei per cluster and three permutations at 2,000 and 3,000 nuclei per cluster. Each of these permutations was run through the pySCENIC pipeline multiple times, resulting in 27 instances of regulon detection. These 27 instances were compiled into the consistency scores displayed in Fig. 3 and Extended Data Fig. 6. Experiments involving immunohistochemistry of human tissue were replicated on, at minimum, samples from five humans, and images displayed are representative of staining observed in multiple fields of at least three human samples./p>